L’esame del liquido seminale deve essere ritenuto un esame d’importanza centrale nel percorso diagnostico finalizzato al trattamento del maschio infertile.
Sebbene non unico tra gli accertamenti di solito richiesti in ambito andrologico, l’esame seminale eseguito correttamente permette di distinguere le cause maschili da quelle femminili nell’infertilità di coppia e consente di seguire una giusta direzione sia nelle indagini da effettuare a completamento dell’iter diagnostico, sia negli eventuali trattamenti da pianificare.
La corretta valutazione della situazione seminale consente, in altre parole, di non intraprendere percorsi errati nella valutazione dei fattori d’infertilità di coppia, che condurrebbero a spese inutili e a perdite di tempo prezioso; allo stesso modo consente di stabilire quale trattamento, compresi quelli di fecondazione assistita, sia più idoneo al caso considerato.
Ciò che con queste linee guida si vuol sottolineare è l’importanza di un esame da sempre ritenuto di ruolo secondario, non solo nella considerazione dei clinici, quanto nei tariffari regionali che fanno corrispondere a questa prestazione una tariffa irrisoria rispetto al significato dello stesso.
Non ultimo, il significato dell’esame seminale si associa anche a quello della prevenzione di specifiche patologie andrologiche che, anche se non direttamente associate alla fertilità, diventano rilevanti nella compromissione dello stato di salute generale dell’individuo.
Affinché tale esame diventi finalmente significativo, il personale addetto dovrebbe avere una preparazione adeguata al termine di un percorso di training serio e qualificante, nonché attenersi a linee guida riconosciute, che consentano di dare un'interpretazione univoca ai dati refertati indipendentemente dal laboratorio presso il quale l'esame viene fatto.
Ci auguriamo, con queste linee guida, di costituire un riferimento per tutti quelli che vedono nell’esame seminale un esame serio e rigoroso, di contribuire alla formazione professionale di coloro che eseguono l’esame e alla diffusione sempre maggiore di un atteggiamento di attenzione verso le patologie maschili.
Il presente protocollo è stato ricavato,con alcune modifiche,dalle linee guida redatte nel workshop di Roma del 2003 approvate dalle varie Società Scientifiche del settore.

NORME PER LA RACCOLTA DELlO SPERMA o CAMPIONE SEMINALE

• GIORNI DI ASTINENZA
  

• MODALITA’ DI RACCOLTA
  

• TIPO DI CONTENITORE
  

• MODALITA’ DI CONSEGNA
  

• MODALITA’ DI COMUNICAZIONE DELLE ISTRUZIONI
  

I.   GIORNI DI ASTINENZA

E’ indispensabile indicare al Paziente un numero minimo e massimo di giorni di astinenza da eiaculazioni prima di raccogliere il campione utile all’analisi, si suggeriscono due possibilità, la prima secondo il manuale WHO è più ampia, la seconda basata sull’esperienza è più stretta e consente una valutazione più standardizzata e meno soggetta a variazioni casuali:
2 – 7 giorni (WHO, 2000)
3 – 5 giorni

II. MODALITA’ DI RACCOLTA

E’ indispensabile indicare al Paziente che l’unica modalità di raccolta accettabile è la   Masturbazione e che è, inoltre, indispensabile indicare al Paziente la sede dove deve essere raccolto il campione.
E’ essenziale che il campione venga raccolto in Laboratorio, specie se esistono motivi biologici o medico legali che impongono tale scelta.
E’ accettabile che il campione venga raccolto in altra sede (es. casa) specie se esistono motivi psicologici od organizzativi che impongono tale scelta. Il campione deve comunque giungere al laboratorio entro un tempo massimo di 30’ e con condizioni di trasporto a temperatura costante (vedi punto IV).

Pertanto:

La raccolta andrebbe effettuata presso il laboratorio; su motivata richiesta del paziente può essere consentita la raccolta in ambiente domestico.
La raccolta domiciliare deve essere assolutamente vietata nel caso in cui  l’esame venga eseguito  per  motivi  medico-legali (cause di disconoscimento) o in caso di crioconservazione.

III. TIPO DI CONTENITORE
E’ indispensabile indicare al Paziente il tipo di contenitore da utilizzare per la raccolta. L’unico valido è il contenitore sterile per esame urine ( barattolo a bocca larga)
Contenitori specifici (quali profilattici non medicati)  per l’esame seminale possono essere consigliati solo in casi di difficoltà di raccolta.

IV. MODALITÀ DI CONSEGNA
E’ indispensabile indicare al Paziente i tempi ed i modi di consegna del campione.

Tempi: Consegnare il campione entro 30 min dalla raccolta  se raccolto in sede diversa dal laboratorio.

       Modi: Proteggere il campione dalle escursioni termiche (< 20°C, > 37°C) e trasportare in posizione verticale, senza capovolgerlo, sia per evitare la fuoriuscita di parte del campione, sia per provocare il minor traumatismo cellulare.
NOTE
Non dovrebbero essere accettati dal laboratorio i campioni raccolti:
in contenitori non idonei
in maniera non completa o non idonea
dopo un periodo di astinenza diverso da quello raccomandato
(a) Contenitori
Vengono considerati non idonei:
contenitori sterili troppo piccoli (provette, contenitori per le feci)
contenitori d’altro tipo
(b) Raccolta
non completa: perdita di una frazione dell’eiaculato
non idonea: effettuata con coito interrotto o con preservativo
(c) Astinenza
inferiore a 2 gg
superiore a 5 gg
E’ opportuno ricordare al paziente che per astinenza  si intende mancata eiaculazione (rapporto, masturbazione, polluzione notturna).

In tali casi sarebbe consigliabile non eseguire l’analisi ed invitare il paziente a ripetere il prelievo.
Queste tre indicazioni possono essere disattese se:
l’analisi deve essere eseguita necessariamente a causa di interventi chirurgici, inizio di chemioterapia o radioterapia, impossibilità fisica del paziente a ripetere la raccolta, grave difficoltà del paziente ad eiaculare.
in tali casi è comunque opportuno registrare: il tipo di contenitore usato, la frazione dell’eiaculato persa, il tipo di raccolta.

N.B. Rilevazione dati anamnestici
Al momento della consegna del campione è indispensabile che il seminologo compili una scheda di raccolta dati che riporti i dati anamnestici, le norme che il paziente ha osservato per la raccolta seminale.

In questa fase si valutano:
Volume
pH
Aspetto
Fluidificazione
Viscosità
Tali variabili dovrebbero essere valutate a 30’ dall’eiaculazione.

VOLUME (valore di riferimento WHO ? 2,0 ml)

Il volume dell’eiaculato si valuta in ml in una provetta conica graduata.
Se il volume dell’eiaculato è inferiore o uguale al millilitro deve essere valutato mediante una micropipetta a volume variabile.


pH ( valore di riferimento ?7,2 < 8,0 )

Il pH si valuta utilizzando cartine al tornasole con un range molto stretto, per es. 6,4 -6,6 – 6,8 – etc.- > 8,0.
Si depone una goccia di 1-2 ml sulla cartina e si legge il colore a 10 sec confrontandolo
con l’apposita striscia colorimetrica.


ASPETTO

Viene valutato ponendo la provetta di fronte a una fonte luminosa.
L’aspetto fisiologico del seme è avorio opalescente.        Proprio o Fisiologico o Normale

Può  essere:  

trasparente se la componente cellulare è molto scarsa,          Acquoso
rosato o rosso o rosso bruno in caso di presenza di emazie       Ematico
biancolatte se è costituito solo da secreto prostatico              Lattescente
bianco-giallastro in caso  di piospermia            Pioide
giallastro in presenza di pigmenti            Giallastro

FLUIDIFICAZIONE

Viene valutata facendo percolare il seme da una pipetta lungo le pareti della provetta e osservando il fluido in trasparenza contro una sorgente luminosa.

Il processo di fluidificazione avviene in un tempo variabile tra 10 e 60 minuti. Talvolta può richiedere un tempo maggiore e quindi è opportuno rivalutarlo entro 2 ore dall’eiaculazione. Oltre questo limite se permangono coaguli o filamenti la fluidificazione viene considerata incompleta.

Viene definita:
Fisiologica o Completa o Normale
Irregolare o Incompleta
Finemente irregolare
Ritardata


VISCOSITÀ

Viene valutata facendo gocciolare il liquido seminale da una pipetta.

Viene considerata normale se le gocce si staccano una dopo l’altra in maniera ritmica e sequenziale. Viene considerata aumentata se le gocce sono sostituite da un unico filo e diminuita se è presente una scarsa componente cellulare e le gocce si staccano più rapidamente.

Viene definita:
Fisiologica o Nei limiti o Normale
Aumentata e definita con codice qualitativo : (+) (++) (+++)
Diminuita

valutazione microscopica

componente  gametica (cioè degli spermatozoi)
componente  cellulare  non   nemaspermica

2b. VALUTAZIONE MICROSCOPICA

Inizia con la fase di ALLESTIMENTO dei PREPARATI

Si allestisce un preparato con una micropipetta da 10 ml; prima di prelevare la goccia si miscela delicatamente il campione per rendere omogenea la distribuzione cellulare.

Si allestiscono almeno 2 preparati per campione utilizzando un vetrino coprioggetto da 18x18 o 20x20 o 21x26

Si osservano i preparati con obiettivi da  20 o, 40X e si controlla l’omogeneità della distribuzione cellulare.

Terminato l’allestimento dei preparati si passa alla VALUTAZIONE MICROSCOPICA che si distingue in :

valutazione degli spermatozoi
valutazione della componente cellulare non nemaspermica e non cellulare
DELLA COMPONENTE CELLULARE GAMETICA

Per lo studio dei gameti maschili o nemaspermi è necessario rilevare sempre i seguenti tre parametri:

Numero à


NUMERO SPERMATOZOI

Questa variabile si distingue in:
Concentrazione/ml (valori di riferimento: WHO ?  20 x 10/ml)/eiaculato (valori di riferimento :WHO ? 40 x 10/eiac.)
essere utilizzate le seguenti camere di conta: Makler, Thoma, Burker, Neubauer

L'assenza di gamenti si definisce AZOOSPERMIA . di assenza di spermatozoi in sospensione è necessario centrifugare l'eiaculato (10 min a 3000 rpm) e ricercare gli spermatozoi valutando l'intero sedimento.

Quindi, in assenza di spermatozoi nel sedimentoè possibile definire il paziente azoospermico.

MOTILITA'

Modalità di valutazione

La motilità nemaspermica viene valutata, in percentuale, su un preparato a fresco utilizzando l'obiettivo a 40X (in contrasto di fase) a tempi fissi dalla eiaculazione (1 ed opzionale 2 h) ma comunque sempre al termine del processo di fluidificazione. essere esaminati almeno 10 campi microscopici per preparato, comunque, non meno di 100 elementi nemaspermici. campioni a bassa concentrazione è necessario ripetere la valutazione su più preparati.  

La motilità può essere valutata anche con il CASA system (Computer Aided Sperm Analysis) che consente di quantizzare velocità, linearità, ampiezza e frequenza dei battiti laterali della testa impiegando un software di elaborazione di immagine che trasforma la visione microscopica in immagine digitalizzata analizzabile dal computer.

Tale analisi può sostituirela valutazione microscopica ma può solo affiancarla.

La motilità deve essere sempre definita sul piano qualitativo.  à di definizione
Lineare velocelentain loco o in situ

Valori di riferimento:
? 50%  ( 1 + 2 = a + b secondo WHO 2000 ) di cui ? 25%  ( a  secondo WHO 2000 )


MORFOLOGIA

Lo studio della morfologia spermatica su striscio cellulare viene definita
Per eseguire uno “spermiocitogramma“ è necessario allestire per ogni campione più vetrini che verranno poi processati secondo la tecnica di preparazione più appropriata e valutati al microscopio ottico con l'obiettivo 100X.

I. Fase di allestimento dei preparati

Utilizzare vetrini con bordo smerigliato su cui può essere riportato il codice identificativo del paziente.una goccia di 10 ?l sul vetrino, alla fine del bordo smerigliato.una estremità del vetrino coprioggetti (24x32 o 24x50) nella goccia e lasciare che il liquido seminale diffonda lungo il bordo. , per tutta l'estensione del vetrino, con estrema delicatezza al fine di procurare il minor danno possibile agli spermatozoi.asciugare all'aria.i vetrini in etanolo assoluto o al 95% o in metanolo per 15'.asciugare all'aria e colorare.

Fase di colorazione dei preparati
possono utilizzare le seguenti colorazioni:
Colorazione di May-Grünwald-Giemsa  di  Papanicolau Diff Quik

III. Fase di valutazione morfologica dei preparati

E' necessario distinguere con accuratezza almeno:
Forme tipicheatipiche, distinte in atipie della testa, del collo e della coda,residui citoplasmatici, atipie complesse

Segnalare eventuale presenza di prevalenza di una atipia specifica e se a carico della testa del collo o della coda (es. teste a palla , code mozze, colli angolati etc..)

di riferimento WHO:atipiche ? 85%  

:

Il TEST DI VITALITA'  (colorazione con eosina per rilevare la percentuale di spermatozoi vitali) può essere di grande utilità clinica, data la sua semplicità è consigliabile inserirlo nella valutazione seminale in caso di motilità ?30%.di riferimento ? 70% spermatozoi vitali.

IV. Fase di valutazione della COMPONENTE CELLULARE NON NEMASPERMICA

Vengono valutate le seguenti componenti:
Leucociti linea germinativaepiteliali di sfaldamentodi spermioagglutinazioneprostatici

Per ogni componente è necessario segnalare nel referto la presenza e le caratteristiche tenendo conto delle specifiche di seguito riportate.

Sono rappresentati prevalentemente dai neutrofili, caratterizzati da nucleo plurilobato.valutati a fresco, con obiettivo 20-40X  e possono essere quantizzati in camera di conta (Thoma, Burker, Neubauer) ed espressi in milioni/ml e successivamente vengono valutati dopo colorazione (May-Grünwald-Giemsa).
Valore di riferimento < 1x10/ml

Non dovrebbero essere presenti nell'eiaculato.presenti vengono contate per campo visivo (pcv) con l'obiettivo di 20-40X.

linea germinativa
Sono frequentemente presenti nell'eiaculato e sono rappresentati da: spermatociti primari e spermatidi; più raramente spermatogoni e spermatociti secondari.valutati a fresco, con obiettivo 20-40X  ed indicati come rari, presenti o numerosi e successivamente vengono valutati  dopo colorazione (May-Grünwald-Giemsa)loro presenza assume un'importanza particolare in casi di azoospermia.

epiteliali di sfaldamento

Cellule di sfaldamento derivanti dall'apparato genito-urinario e possono presentarsi o isolate o in piccoli ammassi.valutate a fresco, con l'obiettivo 20-40X, ed indicate come rare, presenti o numerose.

di spermioagglutinazione

Possono essere costituite da aggregazioni cellulari miste (spermatozoi e leucociti o altre cellule) o di soli spermatozoi.valutate a fresco con obiettivo 20-40X ed indicate come rare, presenti o numerose. Se sono costituite solamente da spermatozoi mobili possono essere suggestive della presenza di anticorpi antispermatozoo, e devono essere segnalate come coda-coda o testa-coda

Corpuscoli prostatici

Sono rappresentati da materiale non cellulare proveniente dalla prostata. valutati a fresco, con l'obiettivo 20-40X, ed indicati come rari, presenti o numerosi.